Биопсия

          При этом виде биопсии часть органа или целый орган иссекают оперативным путём. Следует отметить, что все ткани, извлечённые из организма при любом оперативном вмешательстве, подлежат обязательному морфологическому исследованию. Биоптат фиксируют в любой фиксирующей жидкости, чаще для этой цели используют формальдегид, и затем проводят полную обработку ткани для гистологического исследования.

          При оперативном вмешательстве часто возникает необходимость в ходе операции определить характер патологического процесса. В этих случаях выполняют срочную биопсию. При данном исследовании вместо фиксирующей жидкости используют метод замораживания тканей в жидком азоте, углекислом газе или в криостате, после чего проводят весь комплекс подготовки ткани для гистологического исследования. Следует отметить, что срочная биопсия по своей диагностической точности уступает плановому гистологическому исследованию.

          При этом виде биопсии тканевые фрагменты получают с помощью специальной иглы или троакара. Последнее используют редко.

          Развитие эндоскопических методов диагностики и лечения привело к увеличению количества эндоскопических биопсий, когда материал получают при проведении эндоскопических манипуляций. При этом виде биопсии получение материала возможно практически из любых отделов мочевой системы. Диагностическое значение этого вида биопсий трудно переоценить. Необходимо учитывать, что объём материала, полученного с помощью эндоскопа чрезвычайно мал. Часто удаётся получить только слизь, покрывающую слизистые оболочки. Именно поэтому целесообразно, если это позволяет клиническая ситуация, для гистологического исследования взять 4-6 биоптатов. Это значительно повышает диагностическую ценность исследования и степень верификации патологического процесса.

          Данную биопсию применяют для исследования жидкого содержимого полых органов или аспирата, полученного из полостей тела или тканей при помощи специальных инструментов. Полученный материал, может быть, подвергнут только цитологическому исследованию.

          Полученный материал подвергают специальной обработке. Его фиксируют 10% забуференным нейтральным формальдегидом. Для решения специальных вопросов могут применять другие фиксаторы, например жидкость Боуэна или жидкость Карнуа, наиболее распространённый метод фиксации материала для цитологического исследования — метиловый спирт.

          После фиксации материал проводят по батарее спиртов восходящей концентрации и заливают в смесь парафина и воска. До недавнего времени материал заливали в целлоидин. Однако этот метод заливки создаёт существенные трудности при дальнейшем хранении материала и не даёт возможности проведения гистохимических исследований. Иногда материал заливают в эпоксидные смолы, что диктуется технологическими особенностями его обработки для решения поставленных задач.

          После этого материал режут на микротоме с толщиной срезов 5–6 мкм и монтируют на предметное стекло, обработанное яичным белком, заливочную среду удаляют и препараты окрашивают. Методики окраски различные. Каждая из них предусматривает решение конкретной задачи. Установление того факта, что определённые составные части клеток и тканей воспринимают и удерживают известные красители с большей интенсивностью, чем другие, имело для морфологии выдающееся значение. Только благодаря этому удалось чётко выявить и отличить друг от друга многочисленные структуры, которые из-за своих показателей преломления были не видны или неясно видны в неокрашенном состоянии. В гистологической технике красители применяют только на эмпирических основаниях, так как, несмотря на многочисленные исследования, не удалось внести ясность в сущность и условия гистологического окрашивания. Если недавно большинство авторов придерживалось химической теории, сводящей окраску к солеобразованию или возникновению комплексных химических соединений, то в настоящее время процесс окрашивания гистологических препаратов объясняют с точки зрения физико-химических механизмов.

          Нередко биопсийный материал подвергают электронномикроскопическому исследованию, что особенно актуально в онкологии. Только с помощью электронномикроскопического исследования можно определить наличие клеток–химер — клеток несущих морфологические проявления различных гистогенетических групп (аденокарциномы и плоскоклеточного злокачественного новообразования, плоскоклеточного и переходноклеточного злокачественного новообразования). Повышение концентрации клеток–химер — объективный показатель злокачественности опухоли.

          Все варианты микроскопического исследования подразделяют на две группы — световую и электронную микроскопию. Световую микроскопию подразделяют на несколько разновидностей: фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную.

          При электронномикроскопическом исследовании изображение объектов исследования возникает в результате направленного потока электронов.

          Световая микроскопия основывается на разрешающей способности микроскопа, направленности светового пучка и свойствах изучаемого объекта который может быть прозрачными и непрозрачным. Именно свойства объекта изменяют физические свойства светового пучка, его цвет, яркость. Это связано с длиной и амплитудой волны, фазой, плоскостью и направлением распространения волны. Для световой микроскопии объекты окрашивают для выявления тех или иных их свойств. Окрашивание изучаемых объектов позволяет судить о тех патологических изменениях, которые формируются в тканях. Например, применение окраски пикрофуксином по Ван Гизону позволяет выявить соединительную ткань за счёт того, что пикрофуксин интенсивно окрашивает коллагеновые волокна в кирпично-красный цвет. Другая окраска, применяемая для выявления соединительной ткани — орсеин. Этот краситель окрашивает эластические волокнистые структуры в чёрный цвет. Если добавить к пикрофуксину и орсеину нитрат серебра, то мы получим наглядную демонстрацию состояния аргирофильных волокон. Таким образом, применив указанные окраски, можно с достаточной долей объективности охарактеризовать состояние волокнистых структур соединительной ткани. В состав соединительной ткани входит ещё и интерстиций. Применение окраски толуидиновым синим, позволяет сделать заключение о состоянии гликозамингликанов интерстиция. Если окраска имеет характерный для красителя цвет — синий, то можно предположить о нормальном состоянии гликозамингликанов, но если появляются различные оттенки розового, то говорят о метахромазии (изменении цветовой гаммы красителя) — показателе накопления и перераспределения гликозамингликанов интерстиция соединительной ткани.

          Для завершения морфологической характеристики соединительной ткани необходим ещё один краситель — альциановый синий, показывающий степень мукоидизации интерстиция, т.е. степень изменения её физико-химических свойств.

          Однако даже такой спектр окрашивания ткани для изучения её на светооптическом уровне недостаточен для заключения о жизнеспособности (кроме случаев очевидного некроза). Этот процесс демонстрирует только электронная микроскопия. При данном исследовании можно получить несколько вариантов изменений. Первое — поверхностная дезорганизация соединительной ткани. При этом увеличиваются межволокнистые промежутки и несколько набухают коллагеновые волокна. В этом случае процесс обратим, и называется мукоидным набуханием. Ликвидация патогенного фактора приводит к стабилизации соединительной ткани, необратимые изменения при этом не развиваются.

          Процесс может прогрессировать и тогда к описанным изменениям присоединяется очаговая деструкция коллагеновых волокон. Выраженность этой деструкции регламентируют выживаемость соединительной ткани. Этот процесс называют фибриноидным набуханием, восстановление соединительной ткани возможно только частично.

          Прогрессирование деструктивных процессов приводит к развитию фибриноидного некроза. Соединительная ткань теряет способность к восстановлению. Вместе с ней гибнет орган, в котором развились эти деструктивные процессы.

          Такая цепочка событий при оценке соединительной ткани развивается в любом органе. Причин вызвавших деструктивные процессы в соединительной ткани может быть много, но вне зависимости от этого тканевая реакция будет стандартна и универсальна.

          Окрашивние для световой микроскопии биологических объектов возможно только после их фиксации. Любые окраски показывают определённые структуры только у мёртвой ткани. После окрашивания препараты заключаются (среда для заключения гистологических препаратов может быть полистирол или канадский бальзам).

          В живых клетках краситель обособляется в цитоплазме и существует в виде вакуоли, не прокрашивая клеточные структуры, однако изучение живых биологических объектов возможно, если применить специальные витальные красители или специальный тёмнопольный конденсор.

          Другой вариант исследования живых и неокрашенных биологических объектов — фазово-контрастная микроскопия, основанная на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта изучения. От этого зависит изменение длины и фазы световой волны. Данный метод применяют для диагностики простейших, при подсчёте клеток пролиферирующих тканей и изучения клеточных культур.

          Поляризационная микроскопия позволяет изучать биологические объекты в свете, образованном двумя лучами, поляризованными в перпендикулярном направлении. Это получают с помощью плёнчатых поляроидов или призм Николя. Поляризация меняется при прохождении лучей света различных оптически разнородных структур. В изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, а в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света в продольном направлении больше, чем в поперечном, то возникает положительное двойное лучепреломление, при обратном взаимоотношении — отрицательное двойное лучепреломление.

          Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, анизотропны и обладают положительным двойным лучепреломлением (миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др.). Сопоставление характера лучепреломления, поляризационного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры. Поляризационная микроскопия — один из гистологических, а также цитологических методов исследования. В поляризационном свете можно исследовать окрашенные, неокрашенные препараты и даже нефиксированные (нативные) срезы тканей.

          Люминесцентная микроскопия основана на способности многих объектов давать люминесценцию при воздействии ультрафиолетового излучения или в сине-фиолетовой части спектра. Некоторые биологические вещества (белки коферменты, витамины, лекарственные вещества) обладают способностью первичной люминесценции. Другие вещества начинают светиться при добавлении к ним красителей флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетках диффузно, но могут избирательно окрашивать определённые химические соединения. На этом основано применение люминесцентной микроскопии. Именно иммунофлюоресценция позволяет выявить различные антигены с высокой степенью специфичности.

          Ультрафиолетовая и инфракрасная микроскопия основана на способности поглощать ультрафиолетовые и инфракрасные лучи определённой длины волн некоторыми веществами, входящими в состав клеток фиксированных, но не окрашенных тканей. Свойством поглощать ультрафиолетовые лучи обладают высокомолекулярные соединения (нуклеиновые кислоты), белки, ароматические кислоты (триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания. Инфракрасную микроскопию применяют преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.

          Электронная микроскопия предназначена для изучения патологических процессов на субклеточном и молекулярном уровне. Изображение с высокой разрешающей способностью формируется благодаря потоку электронов, проходящему в вакууме электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. При трансмиссионной электронной микроскопии поток электронов проходит через изучаемый объект, а при сканирующей электронной микроскопии — отклоняется от прямого пути, формируя изображение на люминесцирующем экране. При трансмиссионной микроскопии изображение плоское, а при сканирующей — объёмное. При электронной микроскопии возможно сочетанием с гистохимическим, иммуноморфологическим и авторадиографическим исследованием.

          Электронная микроскопия требует специальной физической или химической фиксации. Обычно используют биопсийный материал, возможно использование секционного материала, изъятого в максимально сокращённые сроки от момента констатации летального исхода.

          После фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы и режут на ультратомах с толщиной срезов 20–50 нм. Затем их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и изучают в электронном микроскопе.

          При сканирующей электронной микроскопии на объекты напыляют в вакуумной камере электронноплотные вещества и изучают полученные реплики. Они полностью дают представление о состоянии ткани.

          Методы окрашивания при морфологическом исследовании разнообразны и имеют чёткую классификацию. Фиксированные ткани окрашивают для выявления различных клеточных структур, воспринимающих красители в зависимости от их физико-химических свойств. Именно поэтому красители подразделяют на основные, кислые и нейтральные.

          Основные или базофильные красители — красящие основания или их соли (гематоксилин, метилтиониния хлорид, толуидиновый синий). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цвета. Интенсивность окраски (базофилия) зависит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями.

          Кислые или ацидофильные красители — красящие кислоты или их соли окрашивают клеточные структуры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, конго красный, оранжевый и др.) Нейтральные красители содержат и базофильные и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского-Гимзе). Такие красители могут растворяться в определённых веществах, окрашивая их (судан III). Часто для контрастирования структур клетки используют способность этих тканей удерживать или восстанавливать соли металлов (серебро, золото, осмий, свинец). Такие методы окрашивания называют импрегнацией.

          С помощью различных красителей в практической и научной деятельности применяют обзорные окраски для составления общего представления о состоянии исследуемой ткани (гематоксилин и эозин, азур-фукселин и др.), а также специальные окраски для выявления процессов, происходящих в тканях и клетках. Например, окраску суданом III используют для выявления жировых включений в клетках (жировая дистрофия), конго красным — для выявления амилоида и ряд других окрасок.

          Гистохимические методы дают возможность проследить и оценить обмен веществ в тканях и клетках в норме и при патологических состояниях, избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и других метаболитов, определить локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать особенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в тканях и клетках в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохимических методов для диагностики патологических изменений в тканях разнообразен. Для гистоферментохимических исследований используют срезы замороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Для количественной оценки результатов гистохимических реакций применяют гистофотометрию, гистоспектрофотометрию, микрофлюорометрию.

          Цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков позволяет дать предварительный ответ в течение 20–30 мин. Эти методы применяют в поликлиниках и оперативной деятельности. Однако при цитологическом исследовании нарушается взаимодействие между различными клетками и межклеточным матриксом. Кроме того, в цитологическом образце могут отсутствовать отдельные типы клеток. Именно поэтому цитологические данные часто носят предварительный характер, а окончательный диагноз ставят после морфологического исследования биоптата человека. Одна из наиболее эффективных диагностических систем — иммуноцитохимическое исследование. Применение специфических, моноклональных антител и эффективных систем их визуализации, позволяет получить данные, определяющие выбор терапии заболевания и его прогноз. Эти методики особенно эффективны при диагностике опухолей, иммунных, аутоиммунных и воспалительных процессов.

          Авторадиография близка к гистохимическим методам. Она даёт возможность при светооптическом или электронномикроскопическом исследовании визуализировать в клетках или внеклеточных структурах радиоактивный изотоп. Метод позволяет визуально оценить интенсивность метаболизма в клетках и внутриклеточных структурах. При авторадиографии наблюдают динамику процессов метаболизма, так как α- и β-частицы используемых изотопов, локализуясь и перемещаясь в определённых структурах, оставляют след на фотоэмульсии, которой покрывают гистологический или ультратонкий срез ткани.

          Таким образом, современный патолог может использовать разные методы исследования — от рутинных до сложнейших иммуноцитохимических и авторадиографических для диагностики цитологического и биопсийного материала. Выбор методов обусловливается видом материала (мазок криостатный или парафиновый срез), особенностями его фиксации, гистоархитектурными особенностями ткани и конечными целями исследования.